亓文寶：非瘟疫苗攻克難點(diǎn)究竟在哪？

　　非洲豬瘟(African swine fever, ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起的一種急性、熱性、出血性豬傳染病，急性感染死亡率為100%。急性和亞急性ASF常在多種器官上表現(xiàn)出嚴(yán)重的血管性病變，如腎臟出血、淋巴結(jié)彌漫性出血、肺水腫、脾臟充血性腫大、彌散性血管內(nèi)凝血和血小板減少等。其主要臨床癥狀是高熱、皮膚發(fā)紺、有出血點(diǎn)、嘔吐和便血等。因此，ASF被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為必須報(bào)告的法定動(dòng)物疫病之一，我國將其列為一類動(dòng)物疫病。1921年，在非洲的肯尼亞地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)ASF。1957年，歐洲的葡萄牙第一次暴發(fā)ASF疫情，經(jīng)過一段時(shí)間沉默后，該病于1960年在歐洲的一些國家出現(xiàn)并逐漸傳播，2007年底進(jìn)入俄羅斯。近年來東歐一些國家不斷發(fā)生疫情，國際疫情形勢(shì)十分嚴(yán)峻。2018年8月3日，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公布了遼寧省出現(xiàn)我國首例ASF疫情。截至2019年5月13日，全國31個(gè)省(市、自治區(qū))和香港特別行政區(qū)先后出現(xiàn)130起疫情，給我國養(yǎng)豬行業(yè)及相關(guān)產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

　　1.非洲豬瘟病毒的分類及結(jié)構(gòu)特征

　　ASFV是一種有囊膜的單分子線狀雙鏈DNA病毒，屬于雙鏈DNA病毒目、非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬的唯一成員，也是目前已知的唯一的蟲媒DNA病毒。家豬、野豬和軟蟬均為ASFV的宿主，豬單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞為ASFV主要的靶細(xì)胞。

　　病毒基因組全長(zhǎng)約為170-190 kb，基因組中間是一段長(zhǎng)度約為125 kb的保守區(qū)。ASFV的基因組有150-167個(gè)開放閱讀框(ORFs)，編碼150-200種蛋白質(zhì)，其中約50種為結(jié)構(gòu)蛋白，主要結(jié)構(gòu)蛋白有p72、p54、p30、 p49、p220、p62和CD2v蛋白等。

　　2.非洲豬瘟病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白

　　p72蛋白是ASFV的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，由B646L基因編碼。p72是病毒粒子二十面體衣殼的重要組成部分，產(chǎn)生于病毒感染的晚期，約占整個(gè)病毒粒子蛋白的32%。p72蛋白在非洲豬瘟病毒結(jié)合和進(jìn)入受體細(xì)胞過程中有很重要的作用，并對(duì)病毒粒子衣殼的產(chǎn)生起著至關(guān)重要的作用[17]。非洲豬瘟病毒大多數(shù)毒株的毒力都很強(qiáng)，但是免疫原性很低，只有少數(shù)幾個(gè)蛋白具有免疫原性，有研究表明，不同區(qū)域ASFV毒株誘導(dǎo)產(chǎn)生的p72抗體的相應(yīng)抗原表位都相當(dāng)保守。p72蛋白的反應(yīng)原性和抗原性很穩(wěn)定，病毒感染后能夠產(chǎn)生高滴度的抗p72抗體，常被用來作為血清學(xué)檢測(cè)和免疫制劑。p72參與了病毒的吸附過程，針對(duì)p72的抗體可以阻斷病毒與巨噬細(xì)胞的結(jié)合。因此非洲豬瘟單克隆抗體的制備主要是針對(duì)p72蛋白。

　　p54蛋白同樣是非洲豬瘟病毒的重要結(jié)構(gòu)蛋白，由E183L基因編碼，蛋白分子中含有一段跨膜區(qū)域，主要集中于衍生的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜處。p54蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域?qū)Σ《镜鞍捉?jīng)過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜轉(zhuǎn)化成病毒包膜前體的過程十分重要，是非常重要的抗原蛋白。p54蛋白與細(xì)胞質(zhì)動(dòng)力蛋白DLC8可發(fā)生特殊的交叉反應(yīng)，介導(dǎo)病毒的細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸，在細(xì)胞對(duì)病毒內(nèi)攝過程和病毒在細(xì)胞內(nèi)的加工過程中都起著重要作用。p54蛋白在非洲豬瘟病毒的感染早期能誘導(dǎo)caspase-9和caspase-3激活，激活細(xì)胞凋亡作用，進(jìn)而誘發(fā)細(xì)胞吞噬，這是非洲豬瘟發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)。

　　p30蛋白是非洲豬瘟的一種膜蛋白，由CP204L基因編碼，在病毒感染早期表達(dá)，能夠引起機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，因此該蛋白也具有比較好的抗原性，是一種重要的抗原蛋白。研究表明，針對(duì)p30蛋白的抗體能夠抑制病毒內(nèi)化，說明p30蛋白也參與病毒進(jìn)入細(xì)胞的過程[25]。

　　3.非洲豬瘟病毒的單克隆抗體研究

　　由單一B細(xì)胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅針對(duì)某一特定抗原表位的抗體，稱為單克隆抗體。通常采用雜交瘤技術(shù)來制備，雜交瘤抗體技術(shù)是在細(xì)胞融合技術(shù)的基礎(chǔ)上，將具有分泌特異性抗體能力的致敏B細(xì)胞和具有無限繁殖能力的骨髓瘤細(xì)胞融合為B細(xì)胞雜交瘤。用具備這種特性的單個(gè)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)成細(xì)胞群，可制備針對(duì)一種抗原表位的特異性抗體即單克隆體。

　　圖1.單克隆抗體制備過程

　　非洲豬瘟單克隆抗體對(duì)非洲豬瘟病毒的快速診斷、致病機(jī)制、免疫機(jī)制和疫苗的研制有著重大的作用。非洲豬瘟單克隆抗體(ASFV McAb)一是用于免疫學(xué)相關(guān)ASFV檢測(cè)方法的建立，例如用于建立檢測(cè)ASFV抗原的直接免疫熒光試驗(yàn)(DIF)、免疫酶組化試驗(yàn)、夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等;二是用于病毒和抗原結(jié)構(gòu)的研究及ASFV抗原特性的研究及疫苗的研制[26]。

　　4.國內(nèi)外非洲豬瘟單克隆抗體研究進(jìn)展

　　單克隆抗體具有特異性強(qiáng)，敏感性高的特點(diǎn)，從而廣泛應(yīng)用于對(duì)病毒及其特異性抗血清的免疫學(xué)鑒定。

　　早在1984年，Sanz等人就首次制備了針對(duì)ASFV的單克隆抗體，獲得了241株穩(wěn)定的雜交瘤細(xì)胞，對(duì)其中90株(針對(duì)6個(gè)蛋白)進(jìn)行了特異性試驗(yàn)，對(duì)其中60株進(jìn)行了分型。Garcia-Barreno等人于1986年發(fā)表于《Journal of Virology》上的論文，利用所制備的單抗(針對(duì)10個(gè)蛋白)識(shí)別ASFV抗原性的改變，鑒定了來源于非洲、歐洲和美洲不同ASFV毒株的抗原特性，并根據(jù)ASFV抗原性的不同對(duì)ASFV進(jìn)行了分型[20]。Whyard等人于1985年制備了38株ASFV的單抗(針對(duì)5個(gè)蛋白)，利用其中針對(duì)p72蛋白的單抗，建立免疫沉淀和免疫電鏡技術(shù)，并對(duì)P72蛋白進(jìn)行了深入研究。Zsak、Cobbold等人于20世紀(jì)90年代先后制備了針對(duì)P72蛋白的單抗;2018年 Mallory E. Heimerman等人利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)制備了6株針對(duì)非洲豬瘟p72蛋白線性表位識(shí)別的單抗：mAb 85 (aa 165–171);mAbs 65-3 and 6H9-1 (aa 265–280);mAbs 8F7-3 and 23 (aa 280–294);and mAb 4A4 (aa 290–303)。

　　國內(nèi)學(xué)者朱紅等于2007年利用大腸桿菌表達(dá)的不溶性融合蛋白GST-P72，免疫小鼠制備了5株分泌P72的單抗雜交瘤細(xì)胞，用其制備的單抗經(jīng)鑒定具有較好的特異性、穩(wěn)定性、敏感性及較強(qiáng)的生物學(xué)活性，并以此建立了相應(yīng)的ELISA檢測(cè)方法;曹琛福等采用原核表達(dá)的重組蛋白p54制備所得單抗，對(duì)其抗原表位進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)第23-29位、第36-45位、第72-94位、第114-120位和第137-150位氨基酸為p54蛋白抗原位點(diǎn)，有較強(qiáng)的特異性和高親和性，這也一定程度上證明了通過基因工程技術(shù)獲得重組蛋白替代病毒作為抗原來源是可行的。

　　5.展望

　　近年來，國內(nèi)外運(yùn)用基因工程技術(shù)獲得重組蛋白的方法變得越來越成熟、穩(wěn)定和有效，且利用原核表達(dá)系統(tǒng)(如大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng))和真核表達(dá)系統(tǒng)(如桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng))表達(dá)來獲得抗原也十分安全和快捷。通過眾多學(xué)者的研究，發(fā)現(xiàn)p72蛋白是ASFV主要的結(jié)構(gòu)蛋白，因此制備的單克隆抗體也主要針對(duì)p72蛋白。

　　單克隆抗體的試驗(yàn)周期較長(zhǎng)，環(huán)節(jié)也多，所以失敗的概率也很高。目前國內(nèi)主要是針對(duì)p72蛋白來進(jìn)行單克隆抗體的制備，也有針對(duì)較強(qiáng)抗原性的蛋白如p54和p30蛋白的單克隆抗體制備，但相對(duì)較少。如能在對(duì)P72蛋白深入研究的同時(shí)，對(duì)其他抗原性較強(qiáng)蛋白有更細(xì)致的研究，進(jìn)一步制備出相應(yīng)的單克隆抗體，將對(duì)ASFV實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)、致病機(jī)制、免疫機(jī)制和未來疫苗的研制產(chǎn)生積極的推動(dòng)作用。